Nelinearna laserska skenirajuća mikroskopija hemoglobina i eritrocita

Abstract

Oslikavanje eritrocita bez obeležavanja pomoću konfokalne ili epifluorescentne mikroskopije je praktično nemoguće jer se fluorescencija od hemoglobina (Hb) ne može detektovati zbog brzih neradijativnih raspada koji su dominantni u odnosu na spontanu emisiju. Sa druge strane, demonstrirana je značajna dvofotonska apsorptivnost Hb u infracrvenoj oblasti1 kao i dvofotonski pobuđena fluorescencija (TPEF) od novoformiranog fotoprodukta2 nakon interakcije ultrakratkih laserskih impulsa sa Hb. TPEF mikroskopija je korišćena u brojnim studijama za oslikavanje Hb i eritrocita bez obeležavanja.3 U ovom radu prikazane su fotofizičke osobine i potencijalne primene novoformiranog fotoprodukta. Kreirane su fluorescentne mikrostrukture pomoću direktnog laserskog upisivanja na tankim Hb slojevima (micropatterning). Fotoprodukt je okarakterisan pomoću različitih (mikro)spektroskopskih tehnika: emisije nakon vofotonske apsorpcije, UV-VIS apsorpcije i spektralnog oslikavanja. Razmatrane su spektroskopske osobine protoporfirina IX (PpIX) pošto je on strukturni deo Hb i potencijalno može biti prekursor za formiranje fotoprodukta. Takođe, Hb je tretiran vodonik peroksidom da bi se uočila optička i spektroskopska sličnost tako dobijenog jedinjenja i fotoprodukta. Potvrđena je dugovremena fotostabilnost fotoprodukta u periodima od nekoliko meseci. Na osnovu toga što je fotoprodukt moguće dobiti na prostorno i vremenski kontrolisan način, izvršeno je fotoobeležavanje i praćenje kretanja pojedinačnih eritrocita u humanoj punoj krvi zdravog donora.